미생물학 No.21

(2) 분리 및 동정(isolation and identification)
 디프테리아는 외독소로 인해 발병하기 땜누에 검사실에서 신속하게 진단해야 한다. 검체는 주로 위점막에서 채취한 면봉이며 직접도말표본을 만들어 이염소체염색을 실시하여 이염소체를 증명한다. 곤봉 형태의 그람양성박대균으로 크기는 0.3~0.8 X 1.0~8.0 마이크로미터이고 다형태성이다. 염색상에서 배열은 L자, V자, W자, Y자 등으로 책상배열 또는 중국한자 (Chinese letter) 모양을 한다. 특수염색인 Albert's(알버트) 염색, Neisser's염색이나 alkaline methylene blue 단 염색을 실시하면 균체 내에 염색성이 다른 과립이 보이는데 이를 이염소체(metachromatic granules) 또는 Babes-Ernst 과립이라 부른다. 이염소체의 관찰이 Corynebacterium diphtheriae를 확정하지는 못하지만 비인두 도말 염색표본에서 이염소체의 출현은 Corynebacterium diphtheriae를 추정하는 중요한 요소가 된다. 
 Corynebacterium diphtheriae 디프테리아 균은 조건 무산소성이지만 산소배양에서 더 잘 자란다. 발육 최적온도는 섭씨 35도이고, 섭씨 15~40도 범위에서 자란다. 발육조건은 까다로운 편이고 영양우무배지에서 발육은 가능하나 발육상이 불량한데 혈청, 혈액을 첨가하면 잘 자란다. 말의 혈청이 첨가된 Loeffler 혈청배지에서 자라면 특징적인 이염소체가 잘 보이기 때문에 많이 사용하나 오염균도 많이 자란다. 면양혈액우무배지에서 용혈대가 매우 작은 완전용혈성을 보인다. 
 CTBA(cystine tellurite blood agar) 배지는 면양혈구,  소의 혈청, 시스틴(cystine), 그리고 potassium tellurite(K2TeO3)가 첨가된 디프테리아균 선택배지이다. Potassium tellurite의 역할은 정상균무리의 증식을 억제하고 디프테리아균의 성장을 촉진하며 tellurite로 환원되면서 검은색으로 변한다. 디프테리아균은 CTBA 배지에서 섭씨 35도, 24~48시간 배양하면 tellurite를 환원하여 검은색 집락을 만든다. 또 다른 선택배지로는 틴스데일(Tinsdale agar) 가 있으며 이 배지에도 pot.tellurite가 함유되어 있다. 이 배지에서  Corynebacterium diphtheriae는 검은색 집락 저변에 갈색의 후광(halo zone)을 형성하여 다른 Corynebacterium.spp 와 구별할 수 있다. 
 예전에는 CTBA 배지의 집락으로 gravis형, mitis형, intermedius형으로 분류했지만 최근 임상적으로는 큰 의의는 없는 것으로 알려졌다.

 (1) 독소생성능 시험
 검체에서 디프테리아균이 분리돼도 디프테리아 환자라는 의미는 아니다. 외독소에 의해 발병하기 때문에 외독소 분비를 증명해야 한다. 디프테리아 독소는 외독소로서 분자량 62,000의 한 개의 연쇄 peptide로 구성된다. 가장 흔한 시험관 내 독소 생성 증명법으로는 Elek법이 이용되며 주로 표준 검사실에서 실시된다. 디프테리아 항독소(10IU/ml)를 흡수시킨 여과지 조각을 배지가 굳기 전에 배지 안쪽으로 밀어 넣어 굳힌 후 의심되는 균주를 여과지에 직각으로 접종한 다음 섭씨 37도에서 24시간 배양 후 45도 각도로 침강선이 생기면 독소생성균으로 간주한다. 음성일 경우에는 72시간까지 배양하여 확인해야한다. Corynebacterium diphtheriae의 최종동정은 독소생성 시험으로 한다.

 (2) 기타 검사법
 이 외에도 Corynebacterium.spp 를 동정하는 방법에는 API Coryne(bioMerieux, Inc., Durham NC) RapID CB Plus(Thermo Scientific Remel Products, Lenexa, KS) 등이 상품화되어 있으며 다양한 탄수화물 동정시험이 coryneform bacteria를 동정하기 위해 실시된다.

3. 그 밖의 Corynebacterium spp.(Diphtheroids, coryneform bacteria)

 Diphtheroids 혹은 coryneform bacteria란 Corynebacterium diphtheriae 와 형태 및 생물학적 성상이 비슷한 균군을 총칭하는 단어이다. 일반적으로 비병원성이며 면역력이 저하된 숙주에게 주로 감염된다. 임상검체에서 좀 더 자주 분리되는 coryneform bacteria는 Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium pseudodiphthericum, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium xerosis 등이다. 

 1) Corynebacterium jeikeium
 1964년 미국에서 이 균에 의한 심내막염, 패혈증이 보고되었다.