미생물학 No.4

 혈장응고효소에는 결합형(bound coagulase, clumping factor = 응고인자) 과 유리형 (free coagulase)이 있다. 
 결합형 혈장 응고효소는 슬라이드에서 검출할수 있다. 유리슬라이드 위에 토끼 혈장과 세균집락을 혼합하여 응집 여부를 관찰한다. 세균이 결합형 혈장응고효소를 갖고 있으면 응집이 일어난다. 
 유리형 혈장응고효소 시험은 시험관에 EDTA로 처리한 토끼 혈장과 세균집락을 혼합한 부유액을 섭씨 35도의 부유온수조에서 4시간 배양한 다음 응고여부를 확인하는 검사이다. 만일 4시간 안에 결과가 음성으로 나오면 24시간까지 배양하여 결과를 확인해야한다. 초기 4시간 배양중에는 매시간 응고 여부를 관찰해야 하는데, 이는 일부 균주들은 혈장응고효소에 의한 응고를 용해하는 섬유소용해효소 (fibrinolysin, Staphylokinase)를 생산하여 위음성을 나타낼 수 있기 때문이다. 또한 이 섬유소용해효소는 섭씨 37도에서 활성화 되는 경향이 있어 4시간 이후의 배양은 실온에서 실시하는 것이 위음성을 방지하는 데 좋다. 
 혈장 응고효소 음성 포도알균(coagulase Negative Staphylococcus, CNS) 중 Staphylococcus lugdinensis와 Staphylococcus schleiferi는 결합형 응고효소 검사에서는 양성을 보이지만 시험관법에서 검출되는 혈장응고효소에는 음성이며 MRSA의 경우 결합형 혈장 응고 효소 시험에서 반응이 매우 약하게 나타나기 때문에 판독에 주의를 기울여야한다. 보통 결합형 응고효소시험에서 양성을 보이면 유리형 혈장 응고효소 시험은 시행하지 않는다. 그러나 일부 균주는 결합형 혈장 응고효소는 결핍되어 있어도 유리형 혈장응고를 내는 세균들은 효소는 양성을 나타내기 때문에 슬라이드 시험을 통한 결합형 응고효소 시험에 음성인 경우에는 반드시 시험관번에 의한 유리형 혈장응고효소 시험을 통하여 확인해야한다.


 2) DNase 시험과 열안정성 내측핵산분해효소(thermostable endonuclease)
대부분의 세균들이 분비하는 DNase(디나아제) 는 핵산가닥을 연결하는 인산이에스테르결합(phospho diester bond)을 외부에서부터 가수분해하는 외측산가수분해효소(exonulcease)이며 내측에서부터 핵산가닥을 분해하는 내측핵산분해효소(endonuclease) S.aureus와 Serratia marcescens 등 소수이다. 0.2% DNA가 포함된 배지에 두껍게 균을 접종하여 섭씨 35도에서 18~14시간 배양하여 발육된 집락에 0.1% Toluidine blue(0.1% 톨루이딘 블루) 용액을 떨어뜨려서 집락 주위가 연한 핑크색으로 변하면 양성으로 판독한다. Toluidine blue(0.1% 톨루이딘 블루) 또는 Methyl green(메틸 그린)이 함유 된 배지를 사용하기도 한다. 
 다른 방법은 발육된 집락에 2N HCl(2 노르말 염산 용액) 을 떨어뜨려 집락 주위에 투명대가 형성되면 DNase 양성으로 판정한다. 
 열안정성 내측핵산분해효소 검사를 할 때는 DNA배지에 균을 접종하기 전에 세균 부유액을 끓인후에 접종해야한다. 

 3) Mannitol salts agar(MSA) 발육능
 이 배지는 S.aureus 선택배지로 억제물질로는 7.5% 식염이 첨가되며, 만니톨과 지시약으로 페놀 레드가 포함되어 있다. 식염에 내성이면 발육이 가능하고 첨가된 당을 분해하면 산이 만들어져 배지가 노란색으로 변한다. 

 4) 신속동정용 키트
 여러 Staphylococcus spp. 를 구별하는 신속동정용 kit가 최근 여러 종류가 개발되어 시판되고 있다. 동정에 필요한 여러 가지 생화학 성상고 ㅏ당 분해 배지를 소시험관에 배열한 API Staphylococcus(bioMeriux, Inc,. Durham, NC)와 혈장을 도포한 라텍스 입자를 사용하여 혈장결함응고효소(clumping factor)와 황색 포도 알균의 세포벽 성분인 A단백 (A protein) 도 함께 측정할수 있도록 구성된 BBL Stayhyloslide(BD Diagnostic System), Staphaurex(Remel, Lenexa, Kan.) 등이다. 이러한 kit들은전통적인 동정 방법에 비해 높은 특이도와 예민도를 나타내서 많이 이용되고 있다. 임상검체에서 자주 분리되는 Staphylococcus spp. 차이점에는 크게 Free coagulase, DNase, Nonobiocin 등이 있다.